小鼠精原gan細胞分離富集和培養

成年小鼠gao丸中約有108個細胞,其中約有 2×104個是精原gan細胞,僅占gao丸生精上皮細胞總數的 0.02～0.03%,精原gan細胞數量太少不利于體外培養.分離和富集精原gan細胞成為精原gan細胞體外培養能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實驗對象,先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清終止消化,用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細胞懸液,30%percoll不連續密度梯度法離心富集精原gan細胞,再根椐未分化精原gan細胞表面thy1.2(CD90.2)陽性CD117(c- kit)陰性特點用流式細胞儀將精原gan細胞分選出來,并在體外進行培養嘗試. 結果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽性細胞占13.80±3.34%,CD90.2陽性細胞占28.98±4.51%, 二者都陽性細胞占8.98±2.98%,CD117陰性CD90.2陽性細胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽性細胞占12.37±3.34%,CD90.2陽性細胞占56.98±4.51%,二者都陽性細胞占 8.20±3.98%,CD117陰性CD90.2陽性細胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽性細胞和二者都陽性細胞所占百分比前后 比較差異無顯著性(P>0.1),CD90.2陽性細胞和CD117陰性和CD90.2陽性細胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標志分子,percoll離心后細胞懸液經FACS分選后獲得細胞純度

流式細胞分選

流式細胞分選技術是利用流式細胞分選儀，以高能量激光照射高速流動狀態下被熒光色素染色的單細胞或微粒,測量其產生的散射光和發射熒光的強度,從而對細胞(或微粒)的物理、生理、生化、免yi、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態等進行定性或定量檢測的--種現代細胞分析技術，它可根據發射光的熒光強度和波長將發光顆粒亞群分開并可實現單ke隆分選，能復雜樣本中的細胞進行鑒定、分類、定量和分離,單次可同時對其中一種到四種特定細胞進行超高速分選純化、高通量單分選或細胞芯片制備。幾乎針對任何種系任何細胞的任何一種單抗或多抗,均可用于間接標記。分選后的細胞能直接用于培養、移植、核酸提取、單細胞PCR擴增或原位雜交等，可進一步進行細胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同細胞之間的差異化研究。硬件中樣本細胞丟棄的比例低于5%，保證樣本中目標細胞的高回收率。

細胞培養中常見的污染及解決方法

原生動物污染

原生動物污染后，細胞培養基變得輕微渾濁。2作為標志分子,percoll離心后細胞懸液經FACS分選后獲得細胞純度。在顯微鏡下，大量的小點來回移動。雖然此時細胞仍能生長，但繁殖速度減慢，細胞生長狀態不好，邊緣不清，變得不透明。原生動物與細胞形成共生關系。同時，原生動物與細胞競爭營養。這種共生現象非常普遍，但以細胞為主，因為原生動物的數量相對較少，因而對細胞的正常生長沒有影響，只有當它們達到一定數量時，才終爆發成為循環。

解決方法：原生動物污染的原因有很多，如液體消毒問題、操作問題、環境問題等，如果細胞足夠，果斷丟棄被污染的細胞和復蘇細胞。如果要保留，需要購買使用相關的滅菌試劑。

Q:如何避免中沉淀物的出現？

A:首先要注意正確的解凍步驟，而且溶解過程中一定要每隔一段時間均勻而緩慢的搖動。我們已經發現在下列情況下沉淀物可能增加，使用中應該盡量避免：

（1）熱滅活；

（2）在 37℃ 下培養；

（3）反復凍融；

（4）γ 射線照射；

（5）長期儲存在 2-8℃；

（6）在室溫下放置時間過長

Q:如何去除中的沉淀？

A:如想去除這些絮狀沉淀物，可以將分裝到無菌離心管中，以 400g 離心，上清液即可直接加入到培養基 內一起過濾。

注意：不要以過濾的方式去除這些絮狀沉淀物，因為這可能阻塞濾膜。