小鼠精原gan細(xì)胞分離富集和培養(yǎng)

成年小鼠gao丸中約有108個(gè)細(xì)胞,其中約有 2×104個(gè)是精原gan細(xì)胞,僅占gao丸生精上皮細(xì)胞總數(shù)的 0.02～0.03%,精原gan細(xì)胞數(shù)量太少不利于體外培養(yǎng).分離和富集精原gan細(xì)胞成為精原gan細(xì)胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細(xì)胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清終止消化,用一次40-um孔徑的濾器過(guò)慮制成單 細(xì)胞懸液,30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細(xì)胞,再根椐未分化精原gan細(xì)胞表面thy1.2(CD90.2)陽(yáng)性CD117(c- kit)陰性特點(diǎn)用流式細(xì)胞儀將精原gan細(xì)胞分選出來(lái),并在體外進(jìn)行培養(yǎng)嘗試. 結(jié)果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞占13.80±3.34%,CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占28.98±4.51%, 二者都陽(yáng)性細(xì)胞占8.98±2.98%,CD117陰性CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞占12.37±3.34%,CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占56.98±4.51%,二者都陽(yáng)性細(xì)胞占 8.20±3.98%,CD117陰性CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞和二者都陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比前后 比較差異無(wú)顯著性(P>0.1),CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞和CD117陰性和CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標(biāo)志分子,percoll離心后細(xì)胞懸液經(jīng)FACS分選后獲得細(xì)胞純度

流式細(xì)胞分選

流式細(xì)胞分選技術(shù)是利用流式細(xì)胞分選儀，以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒,測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度,從而對(duì)細(xì)胞(或微粒)的物理、生理、生化、免yi、遺傳、分子生物學(xué)性狀及功能狀態(tài)等進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的--種現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)，它可根據(jù)發(fā)射光的熒光強(qiáng)度和波長(zhǎng)將發(fā)光顆粒亞群分開(kāi)并可實(shí)現(xiàn)單ke隆分選，能復(fù)雜樣本中的細(xì)胞進(jìn)行鑒定、分類(lèi)、定量和分離,單次可同時(shí)對(duì)其中一種到四種特定細(xì)胞進(jìn)行超高速分選純化、高通量單分選或細(xì)胞芯片制備。幾乎針對(duì)任何種系任何細(xì)胞的任何一種單抗或多抗,均可用于間接標(biāo)記。分選后的細(xì)胞能直接用于培養(yǎng)、移植、核酸提取、單細(xì)胞PCR擴(kuò)增或原位雜交等，可進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同細(xì)胞之間的差異化研究。硬件中樣本細(xì)胞丟棄的比例低于5%，保證樣本中目標(biāo)細(xì)胞的高回收率。

細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染及解決方法

原生動(dòng)物污染

原生動(dòng)物污染后，細(xì)胞培養(yǎng)基變得輕微渾濁。2作為標(biāo)志分子,percoll離心后細(xì)胞懸液經(jīng)FACS分選后獲得細(xì)胞純度。在顯微鏡下，大量的小點(diǎn)來(lái)回移動(dòng)。雖然此時(shí)細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，但繁殖速度減慢，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好，邊緣不清，變得不透明。原生動(dòng)物與細(xì)胞形成共生關(guān)系。同時(shí)，原生動(dòng)物與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)。這種共生現(xiàn)象非常普遍，但以細(xì)胞為主，因?yàn)樵鷦?dòng)物的數(shù)量相對(duì)較少，因而對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)沒(méi)有影響，只有當(dāng)它們達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，才終爆發(fā)成為循環(huán)。

解決方法：原生動(dòng)物污染的原因有很多，如液體消毒問(wèn)題、操作問(wèn)題、環(huán)境問(wèn)題等，如果細(xì)胞足夠，果斷丟棄被污染的細(xì)胞和復(fù)蘇細(xì)胞。如果要保留，需要購(gòu)買(mǎi)使用相關(guān)的滅菌試劑。

Q:如何避免中沉淀物的出現(xiàn)？

A:首先要注意正確的解凍步驟，而且溶解過(guò)程中一定要每隔一段時(shí)間均勻而緩慢的搖動(dòng)。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在下列情況下沉淀物可能增加，使用中應(yīng)該盡量避免：

（1）熱滅活；

（2）在 37℃ 下培養(yǎng)；

（3）反復(fù)凍融；

（4）γ 射線照射；

（5）長(zhǎng)期儲(chǔ)存在 2-8℃；

（6）在室溫下放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

Q:如何去除中的沉淀？

A:如想去除這些絮狀沉淀物，可以將分裝到無(wú)菌離心管中，以 400g 離心，上清液即可直接加入到培養(yǎng)基 內(nèi)一起過(guò)濾。

注意：不要以過(guò)濾的方式去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)檫@可能阻塞濾膜。