成纖維細胞分離方法

1.處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外- -組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出，后用第三組剪刀和鑷子將小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS,再重復此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉移到另- -裝有D-PBS的平皿中，并用手術刀片將其細細切碎。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。

3. 用200 μ的移液反復、快速地吹打平皿中的液體，轉移至15 ml離心管中，于4C 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37C水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。

4.將上層細胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后，以1500 rpm離心5分鐘收集細胞，再用30 ml MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。

5.細胞沉淀用15 ml MEF生長培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù)(- -般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。

6. 3x106細胞懸浮于15 ml MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。

7. 24小時后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。

8.細胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時間不宜過長，作者- -般不超過五分鐘)，按1:5傳代。

9. 細胞再次長到覆蓋率80-90%左右， 將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。

脂質體瞬時轉染

1、細胞H9C2 (Hela) 6孔板Hela1x10°/孔。

2、轉染前換上沒有抗sheng素的DMEM+胎清(10%)。

3、將質粒DNA (約2-4ul) 2ul 加入dorf管中+DMEM至50u1。

4、脂質體5ul補培養(yǎng)基至50ul混勻靜止5分鐘(質粒與脂質體比例為1:2或1.5:2.5)。

5、將含有脂質體的培養(yǎng)基與含質粒的混合總體積100ul室溫放置30分鐘。

6、吸取混合物均勻加入每一個孔中。

7、將6孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6小時后吸出培養(yǎng)基換上新配置的培養(yǎng)基DMEM6ml+胎清600u1+三抗300u1。

8、培養(yǎng)24小時。

目的

學習和掌握外源基因導入真核細胞的主要方法——脂質體介導的轉染。了解外源基因進入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達（綠色熒光蛋白），為染色準備實驗材料。

實驗原理

上圖所示是脂質體介導轉染的示意圖，它顯示了外源質粒進入細胞的一般過程。

外源基因進入細胞主要有四種方法：法、磷酸鈣法和脂質體介導法和病毒介導法。干細bao培養(yǎng)誘導分化干細bao是一類具有自我更新、高度增殖和多項分化潛能的細胞，理論上具有無限分裂能力，在特定條件下，可分化成特定組織。法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入；磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒細胞的方法使得其進入細胞。但是由于法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；病毒法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響；所以現(xiàn)在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉染方法多采用脂質體法。

利用脂質體轉染法重要的就是防止其毒性，因此脂質體與質粒的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養(yǎng)基中的含量都是影響轉染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。

關于細胞培養(yǎng)的常見問題

Q：培養(yǎng)液到底要不要加雙抗（青&鏈）？

A：雙抗不是細胞生長必需的。我們培養(yǎng)細胞時不常規(guī)使用，因為連續(xù)使用會促進耐藥性細胞株的產(chǎn)生，導致輕度污染持續(xù)存在。一旦將從培養(yǎng)液中去除，這種輕度污染終將發(fā)展成為大規(guī)模污染。具體情況，可根據(jù)自己實驗室的環(huán)境，自行決定是否使用雙抗。

Q：細胞培養(yǎng)，能更換成其它種類的培養(yǎng)基嗎？

A：我們強烈建議好使用細胞提供機構或細胞庫推薦的生長培養(yǎng)液。有些細胞可能會適應在不同培養(yǎng)基中生長，在做好保種的條件下，可以分出部分細胞做測試。