MTT檢測

MTT 是一種檢測細胞存活和生長的方法。(-般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。其檢測原理為活xi胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二jia基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免yi檢測儀在 570nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映活xi胞數量。

大鼠gu髓間充質gan細胞的分離

操作方法

(1 )取SD大鼠( 2周齡)，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺內，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉, PBS溶液沖洗兩遍。

(3 )從中間剪斷股骨和脛骨，用2ml無菌注she器吸取DMEM/F 12溶液沖出gu髓細胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸細胞。

(4 )緩慢將細胞懸液加入預先裝有5mL淋巴細胞分離液的15mL離心管內，保持細胞懸液在淋巴細胞分離液上層，注意不要攪動液面,保持二者分層界面。

(5 ) 2000rpm離心15-25min，離心后溶液分4層，吸取中間骨sui基質細胞層(白色渾濁狀)， PBS洗三次。

(6)用含15%胎牛xue清及青鏈mei素的DMEM/F 12以106/mL的細胞濃度接種于25cm2培養瓶中， 置37°C、5%CO2恒溫培養箱中培養。

( 7 ) 24小時后棄去培養液(看細胞貼壁情況)，PBS沖洗2-3次去除末貼壁細胞，加入培養液繼續培養。以后每3d半量換液1次，-般10d細胞生長融合。

(8 )經0.25%胰酶消化，1 : 2傳代，其后一般3-5d傳代1次,選取生長良好的第三代細胞進行后續實驗。

BrdU染色原理

BrdU (5-脫氧尿核苷)是胸腺的衍生物，常用于標記中新合成的DNA,可代替胸腺選擇性整合到細胞中新合成的DNA中(細胞周期S期)。通常改變抑制ES細胞不分化狀態的培養條件,ES細胞就可以分化成多種細胞類型。這種摻入可以穩定存在，隨著DNA進入子細胞中BrdU特異性可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細胞的增殖能力。BrdU特異性可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細胞的增殖能力。

zhu射或細胞培養后利用抗Brdu單，ICC染色，顯示增殖細胞。6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數所顯示出的顏色的斑點。同時結合其它細胞標記物，雙重染色，可判斷增殖細胞的種類，增殖速度，對研究細胞動力學有重要意義。因組織細胞內無內源性Brdu存在，所以Brdu應用較廣摻入雙鏈DNA內的Brdu,以氫鏈與腺呤結合，不能直接與抗Brdu反應，需經解鏈使Brdu暴露方能被染色。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單與增殖細胞核內的Brdu結合，再經酶標抗小鼠IgG孵育、