腺病毒包裝原理介紹

腺病毒是一種沒有包膜的直徑為79-90nm的顆粒，由252個 殼粒呈二十面體排列構成。每個殼粒的直徑為7-9nm。技術流程細胞交聯-→細胞裂解-→免l疫共沉淀→去交聯→RNA分離→建庫→高通量測序(或qPCR)。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子，兩端各有長約100bp的反向重復序列。人體腺病毒 已知有33種，分別命名為ad1-ad33，研究詳細得是ad2.

腺病毒是一種無包膜的球型結構的病毒，遺傳物質為線型 雙股DNA形式。腺病毒的特點：（1）gan染范圍廣對人致病性低；（2）對增殖和非增殖細胞均具有gan染性；腺相關病毒的滴度在10^12~10^13GC/ml,可以滿足各類整體實驗的使用要求。（3）能有效進行增殖；（ 4）病毒滴度高；（5）不整合到染色體中，無插入致突變性；(6)外源基因裝載容量大。由于腺病毒的這些特點使其廣泛地應用于體 外基因轉導、體內接種yi苗、和基因zhi療等各個領域。

實驗方法

1.獲得目的基因序列；

2.構建病毒表達載體質粒；

3.表達載體質粒和包裝質粒重組；

4.gan染HEK293，包裝出病毒；

5.病毒擴增、濃縮；

6.滴度測定。

轉錄組重測序

轉錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功能狀態下所能轉錄出來的所有mRNA的總和。轉錄組研究是基因功能及基因結構等研究的基礎，通過新一代高通量測序，能夠快速的獲得某一物種特定組織或在某一狀態下的幾乎所有轉錄本序列信息，已廣泛應用于臨床診斷、基礎研究和研發等領域。miRNA測序microRNA(miRNA)是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關。

轉錄組Resequencing針對的是有參考基因組的物種。用新一代高通量測序技術對某物種的特定組織或細胞進行轉錄組測序，與參考基因組比較，可以得到基因表達差異、可變剪接、融合基因等遺傳調控信息。

全轉錄組測序

全轉錄組是指特定組織或細胞在特定狀態下所有轉錄產物的總和，包括mRNA和各種noncoding RNA。我們知道生物體本身的轉錄過程是一個動態變化且十分復雜的分子作用網絡，如果只是對某個單一RNA分子的研究，有時并不能準確的發現分子作用機制。而競爭性內源RNA(ceRNA)理論闡述了一種全新的轉錄調控模式：ceRNA（包括lncRNA、circRNA、mRNA、假基因等）分子能夠通過miRNA應答元件（microRNA Respe Element, MRE）競爭性地結合相同的miRNA來調節彼此的表達水平。二、大腸菌群檢驗方法:由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，即:需氧及兼性厭氧、在37°C能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞。舉個例子：miRNA會導致基因沉默現象發生，而如果lncRNA競爭性結合了miRNA，從而影響了miRNA基因沉默功能實現。

ceRNA是目前轉錄調控領域的熱點內容之一，通過全轉錄組研究能夠系統性的闡述ceRNA的分子作用機制。目前對全轉錄組簡便的方法就是構建2個測序文庫分別進行測序。標準的生物信息學分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究內容，靶向調控網絡、ceRNA網絡、共表達網絡分析可以將這幾種RNA聯合起來分析，從而發現新的調控網絡模型。掃描后的圖像用ImageMaster2DPlatinumsoftware軟件進行分析。去除rRNA的鏈特異性文庫，含有的RNA信息含量十分豐富，通過測序和生物信息學分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA的鑒定及注釋信息。不過該文庫構建時會進行片段化選擇從而濾掉了small RNA的信息，所以需要另外再構建一個small RNA文庫，進行測序分析后可以得到miRNA和其他small RNA的鑒定及注釋信息。全轉錄組測序方案路線圖如下所示：

7.如何檢測引物的純度？

答：實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。逆轉錄病毒載體在外源基因表達、基因沉默、、生物制藥等得到廣泛的應用。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。

而有的廠家提供Maldi-TOF質譜QC質量控制，從而保障了合成的準確率：

Bioneer使用多重Maldi-TOF質譜儀進行全自動裝載及監測。 每份樣品的質譜分析數據將自動插入到寡核苷酸的信息單中。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑zhi劑(如二yi丙基氟磷酸,碘yi酸等)。Bioneer是世界上僅有的幾個對生產的每份核苷酸 (單個寡核苷酸和高通量和成) 都用MALDI-TOF質譜儀檢測進行核苷酸QC檢測的廠商，而且免費提供質譜數據。

8.如何計算引物的濃度？

答：引物保存在高濃度的狀況下比較穩定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情況下，建議將引物的濃度配制成50pmol/ul，加水的體積（微升）按下列方式計算：V (微升)= OD數*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。(一):采用三步法，即:乳糖發酵試驗、分離培養和證實試驗。引物的分子量可以從合成報告單上獲得。如果需要配制成其他濃度，按上述公式換算。

注意：1 OD260= 33 ug/ml.