RNA pull down 檢測

RNA pull down：RNA沉淀檢測，是檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實驗方法之一。使用體外轉錄將RNA進行生物素標記，并與細胞蛋白裂解液孵育，形成RNA-蛋白復合物。復合物通過磁珠結合后分離，復合物純化洗脫后通過Western blot驗證檢測特性的蛋白。目前常用的RNA干擾手段為miRNA、shRNA和siRNA等。若篩選可能結合的蛋白通過質譜實驗進行檢測篩選。

RNA提取及注意事項

研究基因的表達和調控時，需要從組織或細胞中分離純化RNA。RNA質量的高低經常影響RT-PCR、cDNA庫構建和Northern Blot等分子生物學實驗的成敗。

主要試劑

Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內含異硫酸胍等物質，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。

1.

Trizol試劑含有，具有毒性和刺激性，注重操作。

2.

RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注重配帶手套，樣品盡可能蓋嚴。

3. 細胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會降低后得率，因為一部分RNA會殘留在未裂解的細胞中。細胞裂解之后要看不見顆粒狀物質（結締組織和骨除外）。在清洗和裂解細胞時在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內源RNase降解了RNA。

4. 酵母和一些細菌由于細胞壁的特別結構，可以加入Trizol試劑同時加入無RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。

20.Primer設計的基本原則是什么？

答：引物設計的下列原則供您參考。

◆引物長度一般在18-35mer。

◆G-C含量控制在40-60%左右。

◆避免近3'端有酶切位點或發夾結構。

◆如果可能避免在3'端5個堿基有2個以上的G或C。

◆如果可能避免在3'端1個堿基為A。

◆避免連續相同堿基的出現，特別是要避免GGGG或更多G出現。

◆退火溫度Tm控制在 58-60C 左右。

◆如果是設計點突變引物，突變點應盡可能在引物的中間。

21.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：引物應該全是DNA，但是OD260/OD280的比值為什么那么低，怎么會有蛋白質污染？引物化學合成，哪里有機會污染到蛋白質？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關。腺病毒包裝原理介紹腺病毒是一種沒有包膜的直徑為79-90nm的顆粒，由252個殼粒呈二十面體排列構成。