三、自噬過程進行觀察和檢測

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。骨吸收陷窩在共培養7天后開始出現,隨著培養時間的延長,陷窩面積呈增加趨勢。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo AV )

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監測(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的現象開發出了此技術。細胞實驗部分設備圖片公司目前擁有多項專利產品及技術，其中發明專利兩項，軟件著作權八項，實用新型專利三項，商標兩件。無自噬時，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。

3、利用Western Blot檢測LC3-II/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會酶解掉一小段多肽，轉變為(自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計自噬水平的高低。分離和富集精原gan細胞成為精原gan細胞體外培養能否成功的前提條件。(注意: LC3對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。方法2和3需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

細胞培養中常見的污染及解決方法

真菌污染

真菌污染后，培養基一般清澈，保持原色。細胞實驗介紹——慢病毒建立穩轉細胞系慢病毒包裝：公司使用3質粒慢病毒包裝系統，慢病毒系統使用pLKO。細絲可以在顯微鏡下觀察到。，一些真菌類似于死細胞碎片，但其中許多清晰可見，看起來像珊瑚，比較容易區分。此外，它們會慢慢長出細細的黑色細絲，因為它們生長得比較慢，不像細菌那樣容易被發現，一旦發現培養基被污染，它們將很難存活。

解決方法：一旦被真菌污染，果斷丟棄，然后對細胞房、CO2 培養箱、器皿和培養基進行消毒。

目的

學習和掌握外源基因導入真核細胞的主要方法——脂質體介導的轉染。了解外源基因進入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達（綠色熒光蛋白），為染色準備實驗材料。

實驗原理

上圖所示是脂質體介導轉染的示意圖，它顯示了外源質粒進入細胞的一般過程。

外源基因進入細胞主要有四種方法：法、磷酸鈣法和脂質體介導法和病毒介導法。(5)把消化所得的軟gu細胞混懸液收集于離心管中，經濾網過濾后用細胞計數板計數,并把細胞混懸液密度調整為2x105/ml接種于25cm2規格的培養瓶中。法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入；磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒細胞的方法使得其進入細胞。但是由于法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；病毒法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響；所以現在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉染方法多采用脂質體法。

利用脂質體轉染法重要的就是防止其毒性，因此脂質體與質粒的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養基中的含量都是影響轉染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。