三、自噬過程進(jìn)行觀察和檢測

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。骨吸收陷窩在共培養(yǎng)7天后開始出現(xiàn),隨著培養(yǎng)時間的延長,陷窩面積呈增加趨勢。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo AV )

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來示蹤自噬形成由于電鏡耗時長，不利于監(jiān)測(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。細(xì)胞實驗部分設(shè)備圖片公司目前擁有多項專利產(chǎn)品及技術(shù)，其中發(fā)明專利兩項，軟件著作權(quán)八項，實用新型專利三項，商標(biāo)兩件。無自噬時，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn) 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當(dāng)于一個自噬體，可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低。

3、利用Western Blot檢測LC3-II/比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計自噬水平的高低。分離和富集精原gan細(xì)胞成為精原gan細(xì)胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件。(注意: LC3對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。方法2和3需結(jié)合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染及解決方法

真菌污染

真菌污染后，培養(yǎng)基一般清澈，保持原色。細(xì)胞實驗介紹——慢病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系慢病毒包裝：公司使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)使用pLKO。細(xì)絲可以在顯微鏡下觀察到。，一些真菌類似于死細(xì)胞碎片，但其中許多清晰可見，看起來像珊瑚，比較容易區(qū)分。此外，它們會慢慢長出細(xì)細(xì)的黑色細(xì)絲，因為它們生長得比較慢，不像細(xì)菌那樣容易被發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基被污染，它們將很難存活。

解決方法：一旦被真菌污染，果斷丟棄，然后對細(xì)胞房、CO2 培養(yǎng)箱、器皿和培養(yǎng)基進(jìn)行消毒。

目的

學(xué)習(xí)和掌握外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的主要方法——脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達(dá)（綠色熒光蛋白），為染色準(zhǔn)備實驗材料。

實驗原理

上圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過程。

外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。(5)把消化所得的軟gu細(xì)胞混懸液收集于離心管中，經(jīng)濾網(wǎng)過濾后用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),并把細(xì)胞混懸液密度調(diào)整為2x105/ml接種于25cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。法是在細(xì)胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴(yán)、難度較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基中的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于效率的提高有巨大的作用。