小鼠精原gan細(xì)胞分離富集和培養(yǎng)

成年小鼠gao丸中約有108個(gè)細(xì)胞,其中約有 2×104個(gè)是精原gan細(xì)胞,僅占gao丸生精上皮細(xì)胞總數(shù)的 0.02～0.03%,精原gan細(xì)胞數(shù)量太少不利于體外培養(yǎng).分離和富集精原gan細(xì)胞成為精原gan細(xì)胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細(xì)胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清終止消化,用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細(xì)胞懸液,30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細(xì)胞,再根椐未分化精原gan細(xì)胞表面thy1.2(CD90.2)陽(yáng)性CD117(c- kit)陰性特點(diǎn)用流式細(xì)胞儀將精原gan細(xì)胞分選出來(lái),并在體外進(jìn)行培養(yǎng)嘗試. 結(jié)果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞占13.80±3.34%,CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占28.98±4.51%, 二者都陽(yáng)性細(xì)胞占8.98±2.98%,CD117陰性CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞占12.37±3.34%,CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占56.98±4.51%,二者都陽(yáng)性細(xì)胞占 8.20±3.98%,CD117陰性CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽(yáng)性細(xì)胞和二者都陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比前后 比較差異無(wú)顯著性(P>0.1),CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞和CD117陰性和CD90.2陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標(biāo)志分子,percoll離心后細(xì)胞懸液經(jīng)FACS分選后獲得細(xì)胞純度

軟瓊脂培養(yǎng)克l隆形成試驗(yàn)基本步驟:

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活l細(xì)胞計(jì)數(shù)，用含20%胎牛血l清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1x106細(xì)胞/L。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋。

(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40日中不會(huì)凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2xDMEM培養(yǎng)基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2xDMEM培養(yǎng)基在無(wú)菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37回5%CO2溫箱中培養(yǎng)10~14天。

(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞數(shù)。計(jì)算形成率。軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測(cè)腫l瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗(yàn)中瓊脂與細(xì)胞相混時(shí)，瓊脂溫度不宜超過40日。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。3、將質(zhì)粒DNA(約2-4ul)2ul加入dorf管中+DMEM至50u1。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克l隆形成試驗(yàn)。

軟瓊脂集落形成率實(shí)驗(yàn)(軟瓊脂克l隆)

將1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2x細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂，6孔板中每個(gè)孔1.4ml溫室凝固，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞濃度為10000個(gè)/ml，將0.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2x細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul單細(xì)胞懸液(約1000ell/wel)， 混勻，室溫凝固。置于37目，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上得克l隆，計(jì)算細(xì)胞集落形成率，Spotll 采集圖像。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35個(gè)，一般6cm的平皿接種1000個(gè)細(xì)胞。

大鼠脂肪的分離

將手術(shù)切取的大鼠脂肪組織盡量剪碎后移至離心管，其余步驟與人脂肪的分離一致。

經(jīng)手術(shù)切除獲得的大鼠皮下脂肪組織消化后原代培養(yǎng)24 h，且肉眼觀察會(huì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶底部貼附著一層網(wǎng)狀薄膜，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶可使這層網(wǎng)狀薄膜從瓶壁上脫落，鏡下觀 察發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞都附著于這層膜上，通過術(shù)獲取的人脂肪組織消化后則無(wú)此現(xiàn)象。增加膠原酶的量和消化時(shí)間也無(wú)法避免，取材時(shí)的或脂肪間結(jié)締組織未被完全消化，穿過細(xì)胞篩進(jìn)入了培養(yǎng)瓶并沉淀于瓶底部形成的。膠原蛋白酶雖然可以特異性水解膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，但不會(huì)損傷其他蛋白質(zhì)。處理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 消化5 min。然后利用40 μm的細(xì)胞篩過濾后傳代。 根據(jù)作者的經(jīng)驗(yàn)，每毫升手術(shù)切除的大鼠脂肪可分離基質(zhì)血管成分細(xì)胞約1.81×106個(gè)。25%胰酶1mMEDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清終止消化,用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單細(xì)胞懸液,30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細(xì)胞,再根椐未分化精原gan細(xì)胞表面thy1。原代培養(yǎng)2.24×10^7個(gè)大鼠基質(zhì)血管成分細(xì)胞，40 h后傳代時(shí)約剩余 6.2×10^6個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞剩余率27%。

2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下 [方法二]：

(1) 以 5×105 細(xì)胞/孔接種 6 孔板 (或 35 mm 培養(yǎng)皿) 培養(yǎng) 24 小時(shí)，使其達(dá)到 50～60% 板底面積。

(2) 在試管中配制 DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：

①在 1 mL 無(wú) DMEM 中稀釋 PSV2-neo 質(zhì)粒 DNA 或供體 DNA。

②旋轉(zhuǎn) 1 秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。

③室溫下放置 5～10 分鐘，使 DNA 結(jié)合在脂質(zhì)體上。

(3) 棄去細(xì)胞中的舊液，用 1 mL 無(wú) DMEM 洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃ 培養(yǎng) 3～5 小時(shí)。

(4) 再于每孔中加入 20%FCS 的 DMEM，繼續(xù)培養(yǎng) 14～24 小時(shí)，

(5) 吸出 DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮 10%FCS 的 DMEM，2 mL/孔，再培養(yǎng) 24～48 小時(shí)。

(6) 用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。

3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：

(1) 接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長(zhǎng)至 50% 板底面積可用于轉(zhuǎn)染。

(2)DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前 (2)、(3) 步驟。

(3) 在每孔中加入 1 mL、20%FCS 的 DMEM，37℃ 培養(yǎng) 48 小時(shí)。

(4) 吸出 DMEM，用 G418 選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間，篩選轉(zhuǎn)染，方法參照細(xì)胞篩選法進(jìn)行。