小鼠精原gan細胞分離富集和培養

成年小鼠gao丸中約有108個細胞,其中約有 2×104個是精原gan細胞,僅占gao丸生精上皮細胞總數的 0.02～0.03%,精原gan細胞數量太少不利于體外培養.分離和富集精原gan細胞成為精原gan細胞體外培養能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實驗對象,先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清終止消化,用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細胞懸液,30%percoll不連續密度梯度法離心富集精原gan細胞,再根椐未分化精原gan細胞表面thy1.2(CD90.2)陽性CD117(c- kit)陰性特點用流式細胞儀將精原gan細胞分選出來,并在體外進行培養嘗試. 結果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽性細胞占13.80±3.34%,CD90.2陽性細胞占28.98±4.51%, 二者都陽性細胞占8.98±2.98%,CD117陰性CD90.2陽性細胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽性細胞占12.37±3.34%,CD90.2陽性細胞占56.98±4.51%,二者都陽性細胞占 8.20±3.98%,CD117陰性CD90.2陽性細胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽性細胞和二者都陽性細胞所占百分比前后 比較差異無顯著性(P>0.1),CD90.2陽性細胞和CD117陰性和CD90.2陽性細胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標志分子,percoll離心后細胞懸液經FACS分選后獲得細胞純度

軟瓊脂培養克l隆形成試驗基本步驟:

(1)取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活l細胞計數，用含20%胎牛血l清的DMEM培養液調整細胞密度至1x106細胞/L。然后根據實驗要求作梯度倍數稀釋。

(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40日中不會凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2xDMEM培養基(含有2x和20%的小牛血l清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7~ 10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2xDMEM培養基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37回5%CO2溫箱中培養10~14天。

(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞數。計算形成率。軟瓊脂培養法常用檢測腫l瘤細胞和轉化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40日。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。3、將質粒DNA(約2-4ul)2ul加入dorf管中+DMEM至50u1。正常細胞在懸浮狀態下不能增殖，不適用于軟瓊脂克l隆形成試驗。

軟瓊脂集落形成率實驗(軟瓊脂克l隆)

將1.2%低熔點瓊脂糖與2x細胞培養基以1:1的體積比混合制備0.6%的底層瓊脂，6孔板中每個孔1.4ml溫室凝固，取對數期細胞，胰酶消化后吹散成單個細胞懸液，計數，并調細胞濃度為10000個/ml，將0.6%低熔點瓊脂糖與2x細胞培養基以1:1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul單細胞懸液(約1000ell/wel)， 混勻，室溫凝固。置于37目，5%CO2的細胞培養箱中培養2-3周，計數含50個細胞以上得克l隆，計算細胞集落形成率，Spotll 采集圖像。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。

大鼠脂肪的分離

將手術切取的大鼠脂肪組織盡量剪碎后移至離心管，其余步驟與人脂肪的分離一致。

經手術切除獲得的大鼠皮下脂肪組織消化后原代培養24 h，且肉眼觀察會發現培養瓶底部貼附著一層網狀薄膜，輕輕搖晃培養瓶可使這層網狀薄膜從瓶壁上脫落，鏡下觀 察發現大部分細胞都附著于這層膜上，通過術獲取的人脂肪組織消化后則無此現象。增加膠原酶的量和消化時間也無法避免，取材時的或脂肪間結締組織未被完全消化，穿過細胞篩進入了培養瓶并沉淀于瓶底部形成的。膠原蛋白酶雖然可以特異性水解膠原蛋白的三維螺旋結構，但不會損傷其他蛋白質。處理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 消化5 min。然后利用40 μm的細胞篩過濾后傳代。 根據作者的經驗，每毫升手術切除的大鼠脂肪可分離基質血管成分細胞約1.81×106個。25%胰酶1mMEDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清終止消化,用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單細胞懸液,30%percoll不連續密度梯度法離心富集精原gan細胞,再根椐未分化精原gan細胞表面thy1。原代培養2.24×10^7個大鼠基質血管成分細胞，40 h后傳代時約剩余 6.2×10^6個細胞，細胞剩余率27%。

2、快速脂質體轉染法操作步驟如下 [方法二]：

(1) 以 5×105 細胞/孔接種 6 孔板 (或 35 mm 培養皿) 培養 24 小時，使其達到 50～60% 板底面積。

(2) 在試管中配制 DNA/脂質體復合物方法如下：

①在 1 mL 無 DMEM 中稀釋 PSV2-neo 質粒 DNA 或供體 DNA。

②旋轉 1 秒鐘，再加入脂質體懸液，旋轉。

③室溫下放置 5～10 分鐘，使 DNA 結合在脂質體上。

(3) 棄去細胞中的舊液，用 1 mL 無 DMEM 洗細胞一次后棄去，向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂質體復合物，37℃ 培養 3～5 小時。

(4) 再于每孔中加入 20%FCS 的 DMEM，繼續培養 14～24 小時，

(5) 吸出 DMEM/DNA/脂質體混合物加入新鮮 10%FCS 的 DMEM，2 mL/孔，再培養 24～48 小時。

(6) 用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。

3、穩定的脂質體轉染方法如下：

(1) 接種細胞同前，細胞長至 50% 板底面積可用于轉染。

(2)DNA/脂質體復合物制備轉染細胞同前 (2)、(3) 步驟。

(3) 在每孔中加入 1 mL、20%FCS 的 DMEM，37℃ 培養 48 小時。

(4) 吸出 DMEM，用 G418 選擇培養液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉染，方法參照細胞篩選法進行。