單核苷酸多態性( SNP )實驗

SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即單核苷酸多態性 ,是由于單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態性(Polymorphism)。當重組病毒載體導入包裝細胞后，缺陷病毒載體和包裝細胞的互補作用共同完成病毒裝配，該病毒顆粒可其它宿主細胞，此時目的基因進入該細胞并整合到細胞基因組中，導致插入序列在宿主細胞中表達，產生目的蛋白。據估計,在人類基因組中,大約每千個堿基中有一個SNP ,無論是比較于度多態性(RFLP)分析還是微標記(STR) ,都要廣泛得多。

實驗方法原理:

SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即單核苷酸多態性,是由于單個核苷酸改變而導致的核酸序列多態性(Polymorphism)。miRNA在物種進化中相當保守，在動物、植物和真菌等中發現的miRNA表達均有嚴格的組織特異性和時序性。據估計,在人類基因組中,大約每千個堿基中有一個SNP ,無論是比較于限制性段長度多態性(RFLP)分析還是微標記(STR) ,都要廣泛得多。SNP是我們考察遺傳變異的單位,據估計,人類的所有群體中大約存在一千萬個SNP位點。-般認為,相鄰的SNPs傾向于一起遺傳給后代。 于是,我們把位于染色體上某一區域的一組相關聯的SNP等位位點稱作單體型( haplotype b大多數染色體區域只有少數幾個常見的單體型(每個具有至少5%的頻率),它們代表了一個群體中人與人之間的大部分多態性。-個染色體區域可以有很多SNP位點,但是我們一-旦掌握了這個區域的單體型,就可以只使用少數幾個標簽SNPs(tagSNP)來進行基因分型,獲取大部分的遺傳多態模式。

RIP

技術概述

RIP是研究體內蛋白與RNA互作的重要技術。MiRNA是一類可以通過RNAi機制調節基因表達的內源性小RNA，人工miRNA與shRNA的設計原理基本相同，由于miRNA具有內源性，因此其更易產生有效的基因沉默。該技術先用甲醛等試劑交聯細胞內的“蛋白-RNA”互作復合物，裂解細胞后，用靶蛋白特異的抗l體(或標簽抗l體)做免l疫沉淀，獲得“靶蛋白-RNA”互作復合物，去交聯分離其中的RNA;針對預測的靶蛋白結合RNA的序列設計引物，

做qPCR實驗，驗證預測的RNA是否與靶蛋白有結合，或者將分離出來的RNA做高通量測序，篩選到可能與靶蛋白結合的RNA。

技術流程

細胞交聯-→細胞裂解-→免l疫共沉淀→去交聯→RNA分離→建庫→高通量測序(或qPCR)。

11.如何溶解引物？

答：干燥后的引物質地非常疏松，開蓋前好離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。細胞內，當F與Promoter相互結合時，它們必然靠的比較近或者契合在一起，這個時候用甲醛處理，能使它們之間產生共價鍵。根據計算出的體積加入去離子無菌水或10mM Tris pH7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩定。

12.如何保存引物？

答：引物合成后，經過一系列處理和純化步驟，旋轉干燥而成片狀物質。引物在溶解前，室溫狀態下可以長期保存。溶解后的引物-20度可以長期保存。如果對實驗的重復性要求較高，合成的OD數較大，建議分裝，避免反復凍融。修飾熒光引物需要避光保存。