成纖維細胞分離方法

1.處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外- -組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出，后用第三組剪刀和鑷子將小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內臟，將其余胚胎轉移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS,再重復此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉移到另- -裝有D-PBS的平皿中，并用手術刀片將其細細切碎。CellCountingKit-8（簡稱CCK-8）是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的檢測試劑。

3. 用200 μ的移液反復、快速地吹打平皿中的液體，轉移至15 ml離心管中，于4C 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37C水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。

4.將上層細胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網過濾后，以1500 rpm離心5分鐘收集細胞，再用30 ml MEF生長培養基洗滌兩次。

5.細胞沉淀用15 ml MEF生長培養基重懸后進行細胞計數(- -般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。

6. 3x106細胞懸浮于15 ml MEF生長培養基中，接種到200 ml培養瓶中。

7. 24小時后更換新鮮的MEF生長培養基。

8.細胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時間不宜過長，作者- -般不超過五分鐘)，按1:5傳代。

9. 細胞再次長到覆蓋率80-90%左右， 將其消化后，常規凍存(凍存液要現配)。

透射電鏡觀察自噬小體方法

利用光學顯微鏡，借助相應的染色方法，可以觀察細胞凋亡時會出現的一系列形態特征。常用的染色法包括臺盼藍、橙 / 化乙啶（AO/EB）、Giemsa 和 HE 法等。在光學顯微鏡下可以觀察到核固縮、質濃縮和凋亡小體等典型的凋亡現象。

電鏡形態學觀察法是一種比較經典、可靠的方法，被認為是確定細胞凋亡的金標準。電鏡下凋亡細胞表現為染色質凝集、核濃縮、核裂解、胞漿收縮和胞膜具有發泡現象及凋亡小體出現等。

平板克l隆形成實驗基本步驟::

1、取對數生長期的各組細胞，分別用0.25%胰 蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在10%胎牛的DMEM培養液中備用。

2、將細胞懸液作梯度倍數稀釋，每組細胞分別以每皿50、100、200 個細胞的梯度密度分別接種含10mL 37預溫培養液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37團5% CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養2~3周。

3、經常觀察，當培養皿中出現肉眼可見的時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數，或在顯微鏡(低倍鏡)計數大于10個細胞的數。后計算形成率。形成率= (數/接種細胞數) x平板形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。平板形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞- -定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。細胞沉淀用15mlMEF生長培養基重懸后進行細胞計數(--般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。