Southern雜交

實驗原理

Southern印跡雜交（Southern blot）是1975年由英國人southern創(chuàng)建，是研究DNA圖譜的基本技術。Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。基于第二代測序技術的miRNA測序，可以一次獲得數(shù)百萬條miRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的miRNA及其表達差異，為研究miRNA對細胞進程的作用及其生物學影響提供了有力工具。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內切酶消化的DNAl片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNAl片段轉移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應結構的標記探針進行雜交，用放l射自顯影或酶反應顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。

RNA提取及注意事項

研究基因的表達和調控時，需要從組織或細胞中分離純化RNA。RNA質量的高低經(jīng)常影響RT-PCR、cDNA庫構建和Northern Blot等分子生物學實驗的成敗。

主要試劑

Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內含異硫酸胍等物質，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。

1.

Trizol試劑含有，具有毒性和刺激性，注重操作。

2.

RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注重配帶手套，樣品盡可能蓋嚴。

3. 細胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會降低后得率，因為一部分RNA會殘留在未裂解的細胞中。細胞裂解之后要看不見顆粒狀物質（結締組織和骨除外）。在清洗和裂解細胞時在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內源RNase降解了RNA。

4. 酵母和一些細菌由于細胞壁的特別結構，可以加入Trizol試劑同時加入無RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。

在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二焦碳酸酯為活性很強的物，須在通風櫥中小心使用）

將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風柜中37℃ 或室溫下處理過夜。

將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC- H2O 處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。

滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用。

玻璃和金屬物品250 ℃烘烤3小時以上。