細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——慢病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

慢病毒包裝：公司使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，過(guò)表達(dá)慢病毒系統(tǒng)使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)粒混勻后使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒顆粒純化試劑盒將慢病毒純化。6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計(jì)數(shù)所顯示出的顏色的斑點(diǎn)。純化后留取部分檢測(cè)病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。

滴度檢測(cè)：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別293T細(xì)胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞熒光量計(jì)算病毒滴度。

細(xì)胞：在病毒前一天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種約10000個(gè)細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后使用無(wú)培養(yǎng)基稀釋病毒，加入12孔板中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行，病毒數(shù)量根據(jù)推薦細(xì)胞的MOI加入（若無(wú)推薦MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,100 5個(gè)梯度對(duì)細(xì)胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。同時(shí)加入puromycin對(duì)細(xì)胞篩選，篩選約2周時(shí)間。從而使得研發(fā)或生產(chǎn)者不必以雜交瘤細(xì)胞為載體保留該，而可以以堿基序列的形式進(jìn)行保存和傳播交流、鑒定。細(xì)胞篩選好后，使用定量PCR和Western blot檢測(cè)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)流程：慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建-HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞-病毒收集-病毒純化-病毒滴度檢測(cè)-細(xì)胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞鑒定

結(jié)果示例：

圖 A 病毒滴度檢測(cè)；B 目的細(xì)胞病毒效果圖

大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

方法：分離大鼠主動(dòng)脈,直接貼壁于培養(yǎng)皿中,熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),免yi組化Ⅷ因子相關(guān)抗原染色鑒定細(xì)胞.結(jié)果:約24小時(shí)組織塊邊緣有游離的 新生細(xì)胞長(zhǎng)出,7天即融合成片.消化傳代后細(xì)胞呈短梭形或三角形,單層生長(zhǎng),鋪路石狀,Ⅷ因子表達(dá)陽(yáng)性,呈指數(shù)增殖.凍存后復(fù)蘇細(xì)胞活性均超過(guò)90%.結(jié) 論:用貼壁法成功建立了大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法,凍存細(xì)胞存活率高,為體外研究提供了穩(wěn)定的模型.

Q:如何避免中沉淀物的出現(xiàn)？

A:首先要注意正確的解凍步驟，而且溶解過(guò)程中一定要每隔一段時(shí)間均勻而緩慢的搖動(dòng)。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在下列情況下沉淀物可能增加，使用中應(yīng)該盡量避免：

（1）熱滅活；

（2）在 37℃ 下培養(yǎng)；

（3）反復(fù)凍融；

（4）γ 射線照射；

（5）長(zhǎng)期儲(chǔ)存在 2-8℃；

（6）在室溫下放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

Q:如何去除中的沉淀？

A:如想去除這些絮狀沉淀物，可以將分裝到無(wú)菌離心管中，以400g離心，上清液即可直接加入到培養(yǎng)基 內(nèi)一起過(guò)濾。

注意：不要以過(guò)濾的方式去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)檫@可能阻塞濾膜。